关于寡核苷酸探针，寡核苷酸这个很多人还不知道，今天小源来为大家解答以上的问题，现在让我们一起来看看吧！1、寡核苷酸科技名...更多寡核苷酸探针的这个问题，以及大家所关心的环形RNA的生物发生、生物学和表征的内容，欢迎大家继续关注我们提供的精彩分享。

寡核苷酸探针

关于寡核苷酸探针，寡核苷酸这个很多人还不知道，今天小源来为大家解答以上的问题，现在让我们一起来看看吧！1、寡核苷酸科技名词定义中文名称：寡核苷酸 英文名称：oligonucleotide 其他名称：寡核糖核苷酸(oligoribonucleotide) 定义1：由20个以下核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的化合物。2、 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；核酸与基因（二级学科） 定义2：由20个以下核苷酸通过3`，5`-磷酸二酯键连接而成单体构成的短链DNA分子。3、 所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 寡核苷酸，是一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸），寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。4、 寡核苷酸合成的DNA（脱氧核糖核酸）可以用于链聚合反应，能放大确定几乎所有DNA的片段，在这个过程中寡核苷酸是作为引物，和DNA 中标的的互补片段结合，作成DNA的复制品。5、 调控寡核苷酸 调控寡核苷酸用于抑制RNA片段，防止其翻译成蛋白，在制止癌细胞活动方面能起一定的作用。6、 寡核苷酸目前推广选择安泰寡核苷酸。本文到此分享完毕，希望对大家有所帮助。

寡核苷酸探针拓展阅读

环形RNA的生物发生、生物学和表征

环形RNA的生物发生、生物学和表征

Kristensen LS et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nat Rev Genet. (2019)

摘要

正文

circRNA的生物发生和特性

cirRNA的生物发生

circRNA的特性

发现和分析circRNA

circRNA全基因组分析

circRNA位点特异性分析

circRNA可视化

circRNA的生物学功能

单个circRNA作为miRNA海绵

单个circRNA通过与蛋白质的相互作用发挥功能

多个circRNA与蛋白质相互作用的协同作用

翻译的circRNA的功能

确定circRNA功能的方法

表征circRNA－miRNA相互作用的方法

表征circRNA－蛋白质相互作用的方法

研究circRNA翻译的方法

RNAi敲降circRNA

敲除circRNA

过表达circRNA

总结和未来展望

摘要

环状RNA（circRNA）是真核生物中共价闭合的内源生物分子，具有组织特异性和细胞特异性表达模式，其生物发生受特定顺式作用元件和反式作用因子的调节。一些circRNA很丰富，在进化上是保守的，许多circRNA通过作为miRNA或蛋白质抑制剂（“海绵”）、调节蛋白质功能或使自身翻译而发挥重要的生物学功能。此外，circRNA与糖尿病，神经障碍，心血管疾病和癌症等疾病有关。虽然这些转录本的环状性质使其在检测，定量和功能表征上具有挑战性，但高通量RNA测序和专门的circRNA计算工具的新进展推动了最先进的cirRNA鉴定方法的发展，新的功能表征的方法也正在出现。

正文

cirRNA是非编码RNA中的一大类，它由一种非经典剪接方式——反向剪接(backsplicing)产生；当反向剪接发生时，下游剪接位点与上游剪接位点共价连接闭合。虽然类病毒不是由反向剪接机制产生的，但是它们是40多年前首次发现的环状RNA分子。几年后，通过电子显微镜在真核细胞系的细胞质组分中观察到circRNA。然而当时它们主要被认为是由异常剪接事件产生的“垃圾”，只有来自性别决定区Y（Sry）基因的睾丸特异性circRNA被认为可能具有功能（在小鼠睾丸中）。近年来，高通量RNA测序（RNA-seq）和circRNA特异性生物信息学算法已经在真核生物中鉴定了数千种circRNA，包括真菌，原生生物，植物，蠕虫，鱼类，昆虫和哺乳动物，并且发现它们具有组织 特定的表达模式。

类病毒 Viroids

小的，环状的单链RNA分子（246-401个核苷酸），未包被且不编码蛋白质。它们对高等植物具有致病性

绝大多数cirRNA由已知的蛋白质编码基因表达，由单个外显子或多个外显子构成。由线性RNA的所有基本类型的可变剪接产生的产物都可以在circRNA中发现，而一些circRNA包含的外显子在线性转录本中却没有。尽管缺乏聚腺苷酸化（poly（A））和加帽，但circRNA通常定位于细胞质。然而，内部的内含子保留可能导致产生含来自外显子和内含子序列的circRNA（称为exon-intron circRNA），并且在经典的剪接过程中内含子套索的脱支失败可导致环状内含子RNA（ciRNA）产生；exon-intron circRNA和ciRNAs位于细胞核中，这些circRNA通过与U1小核核糖核蛋白（snRNP;例如circEIF3J和circPAIP2）的相互作用或通过正调节RNA聚合酶II介导的转录（Pol II）促进其亲本基因的转录（如ci-ankrd52）。

虽然反向剪接一般不如线性剪接的效率高，但是circRNA具有很高的稳定性，可以以时间调节的方式在特定的细胞类型中累积。这种高稳定性想必是它们共价闭合的环结构保护这些分子免受核酸外切酶介导的降解的结果。尽管circRNA通常表达的水平低于其线性对应物，但对于许多基因而言，circRNA是主要的转录物，并且大多数产生circRNA的基因座可能存在经典剪接和反向剪接之间的竞争。有趣的是，大量的circRNA在神经发生过程中被上调，并且一些circRNA在突触中富集。然而，尽管已经提出了circRNA在发育过程中神经元中的许多不同功能和作用机制，但是是否一般终末分化的细胞（例如神经系统中的细胞）更活跃地产生circRNA，又或者由于circRNA的高稳定性导致其在非增殖细胞中累积，还不清楚。与神经组织相比，circRNA通常在癌症和其他细胞增殖率高的疾病中下调，可能是因为它们在达到稳定水平之前被增殖稀释。迄今为止，circRNA已经涉及多种人类疾病，包括糖尿病，神经系统疾病，心血管疾病，慢性炎症性疾病和癌症（方框 1：疾病中的circRNA），并且circRNA在衰老期间累积。

本综述介绍了我们对circRNA生物发生和生物学理解的最新进展，并描述了将进一步推动这一快速发展的研究领域的现代技术。特别地，我们描述了可以对circRNA进行准确定量和功能表征的新方法。

方框１：疾病中的circRNA

由于最近发现内源性环状RNA（circRNA）在所有人体组织中广泛表达，因此越来越关注于表征它们在疾病中的相关性和功能。大多数研究都集中在circRNA在实体瘤中的作用，其中circRNA被描述为致癌基因（例如，头颈部鳞状细胞癌中的circPVT1和结肠直肠癌，食管鳞状细胞癌细胞癌和肝细胞癌中的ciRS-7（CDR1as））或肿瘤抑制因子（例如胶质母细胞瘤中的circMARCA5和circ-SHPRH）。其他circRNA在实体瘤中的功能可能是细胞特异性的；例如，circHIPK3被认为在结直肠癌中是致癌基因，在膀胱癌中被认为是肿瘤抑制因子。而且，因为circRNA的表达水平总是与与临床和病理特征相关，因此这些RNA具有作为诊断、预后和预测的生物标志物的潜力。此外，circRNA的高稳定性允许它们在体液中非侵入地被检测，例如检测乳腺癌患者血浆中的circCNOT2和结直肠癌患者的血清外泌体中的circ-KLDHC。

circRNA在其他人类疾病中的表现较差，但在糖尿病，心血管疾病，慢性炎症性疾病和神经系统疾病的研究中出现了有趣的结果。尤其是在糖尿病中，ciRS-7和circHIPK3通过作为miR-7(cirs-7)、miR-124-3p、miR-338-3p的microRNA海绵，促进胰岛素的分泌并改善β细胞功能。在人类细胞中，circANRIL通过调节核糖体的生物发生、核仁应激，调节血管组织细胞的凋亡和增殖来预防动脉粥样硬化。另一个很重要的circRNA——心脏相关circRNA(HRCR)，它在小鼠模型中预防病理性肥大和心力衰竭。另外，circRNA可能参与系统性红斑狼疮、牛皮廯和神经系统疾病，包括帕金森和阿尔兹海默症。最后宿主circRNA（host circRNA）可作为一种抗病毒的防御机制。例如，一个基因RELL1产生的一个circRNA(hsa_circ_0001400)，在用卡波西肉瘤疱疹病毒感染原代内皮细胞时上调并在转录后抑制病毒基因表达而不影响病毒基因组的拷贝数。

circRNA的生物发生和特性

虽然反向剪接被视为选择性剪接的一种，但是它与线性选择性剪接的分子机制是不同的；然而，circRNA的生物发生的机制仍然相当难以捉摸。

cirRNA的生物发生

circRNA源于经典的剪切位点，在circRNA表达载体中的突变分析，以及用剪接抑制剂isoginkgetin处理HeLa细胞，阻断剪接体装配，都表明circRNA生物发生依赖于经典的剪接机制。相比之下，在黑腹果蝇细胞中的工作表明，通过耗尽U2 snRNP的成分来抑制剪接体显着增加了环状RNA与线性RNA的比例。这些数据显示，当mRNA前体加工事件变慢，新生的RNA会被导向另外一条路——促进反向剪接。这一概念得到了黑腹果蝇的另一项研究的支持，该研究表明，剪接因子的消耗增加了circRNA的水平; 当多个因子耗尽时观察到加性效应，每个剪接因子可能在circRNA的形成中起非冗余作用。反向剪接的主要假设是在下游剪接供体位点和上游剪接受体位点侧翼的内含子序列的环化，使位点得以接近。这种环化可以通过位于上游和下游内含子中的反向重复元件（例如Alu）之间的碱基配对介导，或通过结合到侧翼内含子特定motif的RNA结合蛋白（RBP）的二聚化介导（例如Protein quaking（HQK：QKI基因编码）或者RNA结合蛋白FUS）。然而，在黑腹果蝇中的工作表明，许多circRNA的生物发生受到顺势作用元件和反式作用剪接因子的共同影响，包括异核糖核蛋白（hnRNP）和SR蛋白质（即，含有丝氨酸、精氨酸残基的长重复序列的蛋白质）。

有趣的是，双链RNA(dsRNA) - 特异性腺苷脱氨酶（ADAR）酶（通过在内源性dsRNA上将腺苷修改为肌苷，来阻止先天免疫系统的激活）和ATP依赖的RNA解旋酶A(也被称为DHX9)抑制了依赖于反向重复之间碱基配对的circRNA的生物发生。具体来说就是，腺苷至肌苷的碱基编辑和dsRNA螺旋结构的结旋阻止了内含子序列的环化（FIG. 1a）。相比之下，NF90和NF110,他们都是白细胞介素增强子结合因子3基因（ILF3）的蛋白质产物，在此称为NF90 / NF110，参与宿主抗病毒机制，还可以通过稳定内含子RNA对促进circRNA的产生。

另外，外显子跳跃期间形成套索（可替换的外显子从mRNA中剪接出来，并最终包含在切除的套索内），当套索被反向剪切时，可导致circRNA的形成。最后，未被套索脱支酶水解的内含子套索会形成ciRNA(FIG. 1b)。

许多circRNA中涉及反向剪接的外显子倾向于有很长的内含子侧翼，这些circRNA一般来自具有高活性启动子的基因。另外，组蛋白和gene body区域上表观遗传的改变影响可变剪接，也可能会对circRNA和生物发生有直接影响。这一点还没有被系统地研究，但是最近一项最近的研究观察到DNMT3B（它编码DNA甲基转移酶，主要甲基化gene body区域）的敲降，使circRNA表达发生改变，这种改变与对应线性宿主基因表达无关。circRNAs上调和下调，表明基因体甲基化在circRNA生物发生中的作用依赖于遗传背景。另外，circRNA可以直接影响它们的宿主基因启动子区域的表观遗传状态，例如在乳腺癌细胞的致癌基因Friend leukaemia integration 1 transcription factor(FLI1编码)。这个致癌基因产生FLI1 extronic circRNA(FECR1)，这个circRNA通过募集甲基胞嘧啶双加氧酶TET1诱导顺式CpG位点的去甲基化，TET1是一种诱导活性DNA去甲基化的Fe（II）/ 2-氧戊二酸依赖性双加氧酶。最后，已经有证据表明，产生circRNA的基因的平均转录延伸率高于产生非circRNA的基因。

Alu elements

最丰富的灵长类特异性DNA转座因子，高度重复，由约300个碱基组成。

套索形成　Lariat formation

当内含子的5&39;，5&39;，5&39;剪接位点序列与上游3&39;，5&39;帽和poly（A）尾。然而，如通过工程化的circRNA所证明的，circRNA的帽非依赖性翻译可以通过内部核糖体进入位点（IRES）或在5&39;帽无关的翻译

确定circRNA功能的方法

研究试图通过实验操纵它们的表达水平和表征它们的相互作用分子来阐明circRNA的功能。然而，circRNA的功能表征并不简单，因为大多数circRNA具有可干扰数据解释的线性对应物; 相反，丰富的circRNA可能干扰来自相同基因座的线性转录物的研究。例如，研究显示lncRNA RMST调节多能性和神经发生，在不知不觉中敲除了线性和环状RMST转录物; 随后的研究表明，RMST的主要形式是循环的。在这里，我们讨论可用于表征circRNA的方法（FIG. 5）。表征circRNA－miRNA相互作用的方法

证明circRNA作为miRNA海绵起作用是很具有挑战性的;在circRNA中存在推定的miRNA结合位点不一定表明circRNA抑制这些miRNA。实际上，应考虑潜在海绵中和靶mRNA中miRNA结合位点之间的化学计量关系;靶mRNA抑制的显着降低可能需要circRNA具有许多竞争性miRNA结合位点。优选使用Argonaute交联和免疫沉淀或Argonaute免疫沉淀收集的实验数据来证明circRNA具有真正的miRNA海绵功能。然而，尽管使用这些技术得到的数据提供了Ago蛋白和RNA之间关联的高可信度，但它们并不区分circRNA和线性RNA。因此，circRNA应使用circRNA特异性方法定量，例如具有不同引物设计的RT-qPCR。然而，Ago和目的circRNA和miRNA的免疫共沉淀并不是无可争辩的证据，即circRNA可作为miRNA海绵; circRNA-Ago关联必须对miRNA水平的扰动敏感，并且内源靶标的表达水平和报告分析的活性应分别通过circRNA的过表达和消耗而增加和减少（FIG 5a）。

表征circRNA－蛋白质相互作用的方法

评估circRNA-蛋白质相互作用的方法基于circRNA（以RNA为中心）或蛋白质（以蛋白质为中心）的分离，然后分析分离的组分的相互作用分子。由于这些技术及其相关的挑战已在其他地方详细讨论过，因此我们关注与circRNA-蛋白质相互作用研究相关的具体问题。

在以RNA为中心的方法中，使用靶向目的circRNA的反义探针，诸如RNA反义纯化，RBP的综合鉴定或RNA靶标的捕获杂交分析等技术，从细胞裂解物中提取circRNA和相关蛋白。由于circRNA的唯一独特区域是BSJ，因此必须确认分离的circRNA的身份。如前所述，单个BSJ-spanning探针可以提取目的circRNA。或者，如果细胞裂解物用RNase R或用poly（A）选择试剂盒处理以在提取前除去线性RNA，则可以使用在任何位置靶向circRNA的探针。可以使用低通量方法（例如蛋白质印迹法）或高通量方法（例如质谱法）分析circRNA相关蛋白（FIG. 5b）。

为了鉴定与目的蛋白质相关的circRNA，可在RNA的免疫共沉淀中使用针对该蛋白质的抗体。然后可以通过基因座特异性方法或通过高通量方法如RNA-seq分析与蛋白质相互作用的circRNA。为了使用基于交联免疫沉淀（CLIP）的方法在circRNA上绘制精确的蛋白质结合位点，必须在免疫沉淀之前去除线性RNA。

Argonaute交联和免疫沉淀 Argonaute-crosslinking and immunoprecipitation

一种鉴定和定位与Ago蛋白结合的microRNA和与其相关的靶转录物的方法。

研究circRNA翻译的方法

大多数circRNA由蛋白质编码基因产生，并且circRNA中的推定ORF通常与相应mRNA序列中的经典ORF重叠。因此，只有BSJ下游和推定的终止密码子之前的序列可用于确定蛋白质是否来自线性或环状转录物（图5c）。此外，circRNA通常以低于相应mRNA的水平表达，使得确定circRNA是否被翻译具有挑战性。为了评估是否翻译了circRNA，可以使用荧光素酶报告基因（图5c）或通过分析m6A甲基化来确定ORF和功能性IRES样元件的存在。另外，跨越BSJ的circRNA特异性肽应优先选用质谱法检测。无论是在小基因设置中还是在内源性地使用CRISPR-Cas9，将蛋白标签插入circRNA ORF的推定终止密码子的上游（图5c）也是有用的。如果没有针对circRNA特异性部分肽的抗体可用，则该标签可用于通过蛋白质印迹研究该肽（图5c）。该标签还可分别用于RNA-seq或质谱法鉴定可能与circRNA肽相互作用的RNA或蛋白质，也可用于免疫荧光评估circRNA肽的亚细胞定位。最后，可以使用多核糖体谱或核糖体足迹提供进一步证据表明circRNA被翻译。为了研究circRNA衍生肽的生物学相关性，环状转录物可以异位和内源过表达，或进行敲低或敲除（见下文），并评估对基因表达谱和细胞表型的影响。

多聚核糖体图谱分析技术　polysome profiling一种基于蔗糖梯度分离非翻译和翻译的RNA转录本来研究翻译的技术; 翻译的RNA转录物与多核糖体有关。

核糖体足迹谱技术　ribosome footprinting

一种通过核糖体保护RNA片段的高通量测序来测量翻译的技术，它可以确定核糖体在密码子分辨率下的位置。

RNAi敲降circRNA

功能丧失研究是理解任何circRNA的功能和生物相关性的关键，它们通常涉及RNAi。靶向circRNA的BSJ的siRNA通常对于环状转录物是有效且特异的，尽管使用化学修饰的siRNA（例如锁核酸和非锁核酸）可以提高敲降效率或限制脱靶效应。此外，在针对BSJ时，设计空间受到限制;可能需要使用乘客禁用的siRNA。不幸的是，siRNA的应用依赖于高转染效率，并且这些RNA仅瞬时敲降其靶标。用表达短发夹RNA（shRNA）或AgoshRNA的载体转染细胞，具有较少的脱靶效应，可以使靶标更稳定的敲降。CRISPR-Cas系统，特别是那些使用核糖核酸酶Cas13a的系统，在RNA引导的转录物降解中也是有效的，但尚未用于敲除circRNA。

锁核酸　locked nucleic acids

修饰的RNA核苷酸，其中核糖部分用连接2&39;碳的亚甲基桥修饰。相对于传统的DNA或RNA寡核苷酸，它对其互补核苷酸具有增加的亲和力

非锁核酸　unlocked nucleic acids

非环状RNA核苷酸，缺少传统RNA中发现的核糖部分的C2&39;键。相对于传统的DNA或RNA寡核苷酸，它对其互补核苷酸的亲和力降低乘客缺陷siRNA Passenger disabled siRNA

一种小的干扰RNA（siRNA），其中完整的反义链与片段化的正义链互补。这些siRNA被称为小的内部片段干扰RNA，通过仅允许反义链功能性加入RNA诱导的沉默复合物（RiSC）来消除脱靶效应。AgoshRNAs

短发夹RNA的特征在于相对短的碱基配对茎，这允许它们避免Dicer切割。相反，它们由Ago2的切割活性加工产生sgRNA，进而靶向特定RNA并降解RNA。因为不产生乘客链（passenger strand），所以具有较少的脱靶效应。

敲除circRNA

大多数circRNA来源于蛋白质编码宿主基因，这使得circRNA特异性敲除的产生变得复杂。如果已知对于circRNA生物发生重要的侧翼内含子基序，则从基因组中去除这些元件可以消除或减少circRNA表达而不改变宿主基因的稳态RNA水平。然而，该方法需要先前了解circRNA的生物发生以及仔细确认宿主基因表达未改变。

即使对于没有注释宿主基因的circRNA，例如ciRS-7，在敲除circRNA时也要小心。实际上，因为没有已知ciRS-7的线性宿主基因，所以通过去除产生circRNA的外显子产生ciRS-7敲除小鼠模型。然而，最近的分析鉴定了从与ciRS-7相同的基因座产生的线性RNA，并且显示该线性RNA的稳态水平在ciRS-7敲除模型中增加。该发现提出了ciRS-7敲除小鼠的表型是否是由于ciRS-7的丧失还是线性RNA的表达增加的问题。

过表达circRNA

还可以通过过表达目的circRNA来研究circRNA的功能和生物学相关性;可以表达整个基因或可以使用小基因设置，其中环化外显子（或外显子）侧接经典剪接位点和反向互补序列。互补序列可以是天然存在的重复元件，例如Alu元件，或者可以通过取上游内含子的区域（> 30个核苷酸）并以倒置方向将其插入环化外显子的下游来产生。另一种有利于从质粒表达circRNA转录物的方法是在侧翼内含子中加入特定RBP的结合结构域以促进环化。最后，可以通过基于转移RNA剪接机制的方法过表达circRNA。为了产生过表达某种circRNA的稳定细胞系和动物模型，可以用完整或线性化的circRNA产生质粒转染或转导细胞，并使用抗生素筛选。然而，该方法通常导致随机插入circRNA表达基因座，可能干扰其他基因。对于所有异位circRNA过表达策略的另一个警告是，线性转录本和环状多联聚体通常是共同产生的;当circRNA与线性RNA和多聚体平行表达时，应该通过实验评估产生的线性和环状转录物的量并谨慎解释数据。

总结和未来展望

circRNA研究领域的最新进展揭示了circRNA生物发生和生物学的核心方面，但我们仍需要更多地了解这些分子在健康组织和疾病中的调节和功能。允许在特定细胞类型或亚克隆中，优先选择在单细胞水平上，确定空间和时间基因表达模式的方法将很有帮助。单细胞RNA-seq仅在两项研究中用于检测circRNA，但未来可能会更多地用于研究circRNA的生物学。另一项有前景的技术，名为Digital Spatial Profiling，基于NanoString Technologies的GeoMx　Digital Spatial Profiling平台，可在福尔马林固定的石蜡包埋组织载玻片上，在用户定义的目的区域内实现蛋白质或mRNA的高度多重和空间分辨数字表征。在未来，我们期望对该技术进行调整以允许对circRNA进行定量。最后，Oxford Nanopore MinION技术提供了非常长的测序读数，因此可以解析内部剪接模式，已被用于测序circRNA扩增子，并可能在不久的将来适应全基因组circRNA测序。

circRNA研究领域为我们带来了许多令人惊讶的发现，这意味着circRNA在生物学和病理生物学中具有重要意义。已经通过RNA-seq鉴定了数千种在不同组织和疾病中的推定的circRNA，尽管其中绝大多数尚未通过其他技术验证或在功能上进行研究。本综述中描述的技术将有助于RNA-seq数据的有效验证，并有助于揭示circRNA生物学的新方面。

以上就是关于寡核苷酸探针(环形RNA的生物发生、生物学和表征)的所有内容，希望对你有所帮助。